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 上海申康医院发展中心副主任
 复旦大学医院管理研究所所长
 
 

 
 
 
 

5-氟胞嘧啶/胞嘧啶脱氨酶系统对
人肾母细胞瘤裸鼠异种移植瘤的治疗作用
毕允力 高解春 许德化 姚明
复旦大学附属儿科医院外科

摘要
目的 以肾母细胞瘤移植瘤研究5-氟胞嘧啶(5-FC)作为原药对表达胞嘧啶脱氨酶(CD)的肾母细胞瘤治疗(以下简称CD/5-FC)的作用。方法 裸鼠皮下移植建立人肾母细胞瘤裸鼠移植瘤,观测肿瘤生长和病理形态。在3组实验组中,对第1、第2 组分别以腺病毒载体转导CD或lac基因,另一组为空白对照。RT-PCR证实CD表达,第1、2组腹腔内注射5-FC(500mg/kg)。对照观察肿瘤生长及组织病理变化。结果 裸鼠移植瘤共传4代,为低分化间质型肾母细胞瘤。转导lac基因的移植瘤生长情况与空白对照组并无两样,表达CD基因的移植瘤生长明显受到抑制。在第8周抑瘤率平均为65%。病理观察见CD基因组见细胞大量坏死。 结论 在瘤体内转导CD基因的基础上施以5-FC治疗,对人肾母细胞瘤裸鼠移植瘤有明显疗效。
The effect of 5-flurocytosine/cytosine deaminase system in the treatment ofxenograft human wilms’ tumor in nude

mouse
Bi Yunli Gao Jiechun Xu Dehua1 Yao Ming2
Children’s Hospital of Fudan Univeristy Department of Surgery
AbstractObjective To study the effect of 5-flurocytosine (5-FC) as prodrug in the treatment of Wilms’ tumor

xenografts transduced with cytosine deaminase gene(CD). Methods A Wilms’ tumor xenograft in nude mice was established. Its growth pattern was monitored and histology confirmed. In 3 experimental groups, Adenoviral vectorexpressing CD or lac gene was used to directly transduce the tumor cells by intra-tumor injection in group1 and 2respectively, another group is a blank control without any kind of intervention. The expression of CD was confirmedby RT-PCR. Mice with transplanted tumor were treated with 5-FC(500mg/kg.d for 10 days) in the first 2groups. Tumorgrowth was monitered and histological change observed, and compared with each other. Results Four generations of xenograft Wilms’ tumor were produced, of poorly differentiated anaplastic histological type. The growth of tumorxenografts transduced with lac gene is similar to that of the untranduced ones. But tumor growth is suppressed in group 1 transduced with CD. The average suppression rate was 65% according to tumor weight at 8 weeks. Cell necrosis was observed in the CD transduced tumors. Conclusion Intra-tumor cytosine deaminase gene transduction followed by systemic 5-flurocytosine administration is effective in the treatment of xenograft Wilms’ tumor.
Subject words: Wilms’ tumor/drug therapy, 5-flurocytosine, cytosine deaminase gene


肾母细胞瘤是最常见的一种小儿实体恶性肿瘤。治疗方法包括手术、化疗和放疗。总体生存率超过80%1,但对病理类型为预后不良型患儿预后不良。我们对裸鼠进行人肾母细瘤的移植,在瘤体内直接转导胞嘧啶脱氨酶基因(CD),以药物前体5-氟胞嘧啶进行治疗,了解其对移植瘤的治疗效果。
材料和方法
一. 病毒载体的制备:
将pBluescript/CD中的CD通过酶切克隆入pAdE1CMV,得到pAdE1CMV/CD;以磷酸钙共沉淀法将pAdE1CMV/CD和pJM17共转入293细胞;以

1个细胞中的噬菌斑纯化病毒,在293细胞中扩增,得到含Ad/CMV-CD的上清液,纯化并滴定病毒浓度,-80℃保存:同法制备Ad/CMV

-lac病毒颗粒,-80℃保存。
二. 人肾母细胞瘤的裸鼠移植:
肿瘤标本来自一例5岁女性肾母细胞瘤患儿,手术中取下的肿瘤立即被切成2mm3小块,接种于BLAB/C裸鼠的前臂皮下,裸鼠为8周龄,体重约18-20g。当肿瘤直径达1-2cm时,处死裸鼠取出肿瘤进行下一轮传代接种。移植瘤共传4代。当移植瘤达3mm3时每周测量肿瘤的垂直径。每代移植瘤均进行病理组织学和电镜观察。第2、第4代肿瘤用于进一步实验。
三. CD基因RNA的检测:
1. 瘤体内注射病毒载体:第二代移植瘤直径达3-5mm时, 108病毒载体肿瘤内多点注射。注射后第1、3、5、7、9、11天各处死裸鼠

1只,取出肿瘤-80℃保存。
2. RNA抽提:取100mg肿瘤组织、心脏、肺和肿瘤周围组织用TRIzol液,按使用说明抽提组织RNA。
3. RT-PCR:5ug组织RNA首先经逆转录酶转录成cDNA再进行PCR,共30个周期,PCR条件:变性95℃ 45s,退火58℃ 45s,延伸72℃

45s。引物序列为5’ATAGAATTCAGGCTAACAATGTCTGAATAACGCTT3’,5’TATGGATCCTCAACGTTTCTAATCGATGGCTT 3’。产物经凝胶电泳,紫外光检测扩增条带并拍照。
四. 药物前体治疗:
第4代移植瘤肿瘤大小相似的14只裸鼠被随机分成3组。第1组5只,第2组4只,第3组5只。测量最大径a和与其垂直的最大径b,肿瘤体积v根据公式v=(π/6)ⅹaⅹb2计算,计算3组平均体积,进行t检验。 第1组以108Ad/CMV-CD加入50ul PBS在第1和第3天进行肿瘤内多点注射,第3天开始进行5-FC(500mg/kg)腹腔内注射,连续注射10天。第2组以108Ad/CMV-lac(无CD)加入50ul PBS在第1和第3天进行肿瘤内多点注射,第3天开始进行5-FC(500mg/kg)腹腔内注射,连续注射10天。第3组为空白对照,不进行任何干预。
五. 疗效观察:
1. 肿瘤生长情况:5-FC注射第7天起,盲法定人、定时(每周1次,共8周)测量肿瘤最大径a和与其垂直的最大径b, 根据公式v=(π/6)ⅹaⅹb2计算肿瘤体积,绘制生长曲线。第8周处死裸鼠,取出肿瘤秤取重量,按公式(1-治疗组瘤重/对照组瘤重)′100%求出抑瘤率。
2. 病理及超微结构观察:肿瘤组织常规病理切片,HE染色,标本同时用2.5%戊二醛磷酸缓冲液冲洗固定,缓冲液冲洗再固定于1%OSO4中,脱水后超薄切片,枸橼酸铅、醋酸铀双重染色,JEM1200透射电镜观察。
3. 图象分析仪检测DNA含量及细胞时相:肿瘤标本2-3um切片,分别行HE和Agure染色。采用图象分析仪测定50-100个细胞核,以同张切片间质淋巴细胞核DNA含量均数作二倍体对照,直方图形式打印输出DNA指数(DI)和A区域(G0+G1)、B区域(S)、C区域(G2+M)的百分数。
结果
10个月中连续裸鼠皮下传4代,共移植裸鼠76只。移植1周内局部肿块逐渐消退,7周后肉眼见肿瘤逐渐增大。鼠间传代潜伏期为50天左右。第1代移植瘤6个,成瘤率100%(6/6),第2代21个,成瘤率42.9%(9/21),第3代9个,成瘤率44.4%(4/9),第4代40个,成瘤率40%(15/40)。第2代移植瘤的肿瘤倍增时间见表1。肿瘤生长曲线符合Gompertz模型。组织病理学发现各代移植瘤之间细胞形态一致,细胞呈小圆形,核浆比例大,核染色深,为分化差的间质型肾母细胞瘤。
RT-PCR显示注射病毒载体后肿瘤内可检测到CD基因的表达,而周围肌肉组织及心、肺无转基因的表达,PCR产物约12kb(图1)。 第1组转基因组的肿瘤生长被显著抑制,而2、3两组对照组的肿瘤生长曲线无变化(图2和3)。实验在第8周结束,秤取瘤重,第1组为1-3g,平均2.56±00.39g;第2组6-9g,平均7.22±1.1g;第3组5-10g,平均7.4±1.4g。实验组较对照组瘤重显著减少(p<0.05)。实验组对第2和第3组的抑瘤率分别为64.6%和65.4%。病理观察发现治疗组出现大片肿瘤细胞坏死,无明显炎性细胞浸润,可见较多向间叶组织分化的细胞。在两组对照组病理形态与原肿瘤相同,可见增值活跃的细胞。 超微结构观察发现治疗组肿瘤细胞线粒体明显肿胀,空泡化,核糖体较对照组明显减少,出现较多溶酶体;对照组无上述改变。 图象分析结果提示,各组肿瘤DNA指数基本相同,实验组G0+G1时相细胞(55.3%)较第2组(33.6%)和第3组(6.7%)增高,而G2+M时相细胞(4.4%)较第2组(15.2%)和第3组(27.5%)明显下降,提示细胞增值活性有所下降。
讨论
  随着肿瘤综合治疗的运用,小儿恶性肿瘤的生存率大大提高,肾母细胞瘤的5年生存率从70年代初的58%上升到80年代的75%2。但综合治疗副效应不容忽视,如:一些化疗药物除了常见的胃肠道反应、骨髓抑制外还有肾毒性;接受放疗的患儿常常出现下胸廓的畸形,女孩的第2性征发育异常;部分晚期和组织预后不良的病例治愈率仍偏低,即便侥幸生存,亦往往遗留严重的后遗症,生活质量大大降低。基因治疗目前虽还处于起步阶段,但从1990年Rosenberg等3以neo基因转导肿瘤致敏性淋巴细胞进行肿瘤标记以来,进展迅速,肿瘤的基因治疗已越来越接近临床4。目前临床试验方案中,使用相对较多的酶-药物前体治疗,直接在肿瘤细胞内产生毒性物质,理论上这一方法能在更彻底有效地杀灭肿瘤细胞的同时,对周围正常组织不产生伤害,具有传统治疗没有的优越性。 对于肾母细胞瘤,与细胞培养相比裸鼠移植瘤模型的建立相对简易。移植瘤模型不会被成纤维细胞污染,保留了实体肿瘤生长的特点

,可以观察肿瘤和宿主的相互影响5。肿瘤的生长受限于宿主的营养和血供,早期呈指数型生长,然后遵循Gompertz函数进入平台期

6,7。建立移植瘤的成功率取决于肿瘤的生物特性,肿瘤来源(原发肿瘤、复发或转移)以及裸鼠的状态8。对于肾母细胞瘤,成瘤率为33%左右。我们采用的1例分化差的间质细胞瘤,成瘤率在40%以上。生长曲线和组织学特性在各代之间保持稳定。
本研究采用的治疗方法为自杀基因治疗,通过腺病毒载体转导CD基因,使肿瘤细胞具有胞嘧啶脱氨酶活性,将无毒的5-FC转化为细胞毒性的5-FU.在细胞培养中1%的细胞转染,即可达到杀灭肿瘤细胞的效果,即旁效应9。为充分发挥旁效应,通过多次多点注射使载体均匀分布于瘤体内。腺病毒载体感染性强,无需体外细胞培养过程,可进行瘤体内的直接注射10。通过RT-PCR可以检测到CD基因在肿瘤细胞内的表达。
本实验证实,治疗组较对照组肿瘤缩小50%以上,实验组与对照组肿瘤生长差异有显著性。腺病毒有溶细胞作用,高滴度的腺病毒颗粒亦可暂时性延缓肿瘤的生长。实验中以108载体进行转染,两组对照组肿瘤生长无差别。实验中采用的CMV启动子是万能强效启动子,腺病毒可感染人类各种细胞11,如有周围正常组织的感染可造成周围组织脏器的损伤。本实验RT-PCR显示无其它组织的转染发生,各组裸鼠的一般情况良好。
腺病毒具有较强的免疫原性12,表达基因产物的细胞可很快被人体免疫细胞清除,尤其近来实验表明,自杀基因治疗过程中的旁效应与宿主的免疫机制有密切的关系。本实验采用裸鼠无免疫力未能了解上述因素的可能影响。
本研究将肾母细胞瘤移植至裸鼠,以腺病毒载体对肾母细胞瘤活体肿瘤进行直接基因转导,以CD/5-FC系统进行疗效观察,肿瘤生长

被抑制50%以上,希望以此推动国内小儿肿瘤基因治疗研究的不断深入。
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Table 1. Tumor volume and its doubling time in the 2nd generation of xenograft mice
Weeks after inoculation Tumor volume(mm3) Doubling time
8 135 5.30
9 337 5.75
10 781 5.68
11 1835 21.95
12 2283 40.25
13 2572 43.91
14 2864 43.91
15 3201 60.38
16 3489 96.60
17 3650 69.00
18 3908 161.00
19 4021

Figure 1. CD expression assay in electrophoresis
1: cardiac muscle, 2: lung, 3: surrounding muscle, 4: tumor
Figure 2. Tumor growth curve in three groups

Figure 3. Tumors of 2 experimental groups
a. tumor from group1
b. tumor from group 2


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